arthusbio Ik00303说明书
S-Adenosyl-L-Homocysteine (SAH) ELISA Kit 3
S-腺苷-L-同型半胱安酸(SAH)ELISA Kit3
目录号Ik00303
包装尺寸48测试
检测范围15.625 nM-2000 nM
目标详细信息
甲硫安酸是一种具有硫甲基的氨基酸,通过甲硫安酸腺苷转移酶(EC 2.5.1.6)与ATP一起转化为S-腺苷甲硫安酸(SAM)。SAM是50多种生物活性物质(如DNA、RNA、蛋白质、磷脂、激素和神经传递物等)的甲基供体。甲基在甲基转移酶作用下从SAM转移后,形成S-腺苷高半胱安酸,去除腺苷后进一步代谢为同型半胱安酸(Hcy)。同型半胱安酸通过N5甲基四氢叶酸甲基转移酶(EC1.1.1.68)和辅酶维生素B12催化途径从N5甲基四氢叶酸接受甲基代谢为甲硫安酸。这是蛋氨酸循环。甲基化指数定义为SAM和SAH的比率。甲基化指数是甲基化状态和甲基化的更好标记
能力。
SAH和Hcy将向关键生物分子提供甲基和从N-5甲基四氢叶酸中回收甲基的过程连接起来。蛛网膜下腔出血的水平将决定或反映蛋氨酸循环是否正常。因此,找到一种更好地量化它们的方法具有重要的实际意义。SAH升高可导致血管内皮细胞损伤,这与基因组甲基化水平有关。蛛网膜下腔出血可能是动脉粥样硬化的潜在生物标志物。
该免疫分析试剂盒用于测量可溶性样本中的SAH水平。
测定原理
这种直接竞争ELISA(酶联免疫吸附试验)旨在测量样品中S-腺苷-L-甲硫安酸(SAH)的水平。将与大分子共轭的SAH固定在微升板上。用移液管将标准品和样品移入井中,然后用HRP-
添加抗SAH的共轭抗体。样品或标准品中的游离SAH分子与微滴度板表面上的固定化SAH竞争抗体的结合位点。丢弃混合溶液并清洗每个孔后,添加TMB基质溶液。底物溶液在HRP(辣根过氧化物酶)的作用下变蓝,
停车后变为黄色
添加溶液(酸)。颜色与样品(或标准品)中的SAH量成反比。使用微板分光光度计在450nm处测量剩余溶液(OD450)的光密度。可以通过标准生成的标准曲线计算样本中的SAH水平。
样品收集和储存
1、样品采集必须在4°C下进行。必要时,通过离心去除沉淀,并尽快测试样品或将其储存在-20°C或以下。避免重复冻融循环。
2、避免NaN3,因为它会使HRP失活。
程序
1、将所有试剂重新加热至室温,并充分混合。取出适当数量的孔,将剩余的孔放回原来的密封袋中。密封并储存在-20°C。
2、向每个孔中加入50ul样品稀释剂(空白孔)、标准品和样品。
3、制备HRP抗体溶液:用HRP抗体稀释液按1:250稀释HRP抗体,一周内用完。充分混合并储存在黑暗中。准备一周内使用的适量。注:始终*离心HRP抗体瓶,以回收所有15-17ul HRP抗体。建议收集所有样本,并在一周内进行1-3次实验,使用3.8ml HP抗体稀释液,通过多次洗涤回收小瓶中的所有HRP抗体。
4.将50ul HRP结合抗体添加到空白wll的每个孔中。
5、将平板置于振荡器上,摇动一段时间,使试剂混合,然后用微孔板封闭剂密封平板。将平板在37°C下培养1小时。
6、小心剥离密封剂,并将剩余溶液丢弃在孔中。在每个孔中添加至少300ul洗涤液,并保持该状态30秒,然后去除洗涤液。重复这些步骤3次以完成清洗过程。或者改用自动清洗机。
7、向每个孔中添加TMB基质和100ul混合基质。轻轻摇晃并密封盘子。将培养板在37°C下无光培养15分钟。
8、在反应结束时加入50ul停止溶液。
9.在15分钟内测量每个孔在450 nm波长下的吸光度。根据空白井设置零。
数据处理
始终通过从测试孔的吸光度中减去空白孔450 nm(OD450)处的吸光度来清除背景。
每个孔(标准或样品)的吸收率等于AASO,A是标准孔或样品孔的平均吸光度,ASO是S0标准孔的平均吸光度。
创建标准曲线:通过绘制每个标准品在y轴上的结合率与其在x轴上浓度的对数来构建标准曲线。使用二次多项式曲线拟合数据(r>0.99)。通过将样品的结合速率代入标准曲线方程,可以计算样品的SAH水平。如果样品已稀释,则乘以稀释程度。
笔记
1、在未预热或环境温度低于20°C的情况下使用试剂和样品可能会导致OD450读数降低。
2、洗井后额外干燥可能会对结果产生负面影响,例如标准曲线较差,重复性较差。为了避免这种情况,请在清洗后立即执行下一步。
3、充分混合溶液并*清洗,因为这些程序会影响分析。
4、用微板封闭剂密封板,孵育板时避光。
5、推荐使用标准和样品的重复井,建议使用二次多项式进行标准曲线拟合(R2>0.99)。
质控瓶的检测浓度应在检测范围内。
6、浓缩洗涤液可能形成晶体。将其加热,使盐在稀释前*溶解。
7、每次使用后应处理微孔板密封剂,以避免交叉污染。
HRP基板(TMB)应保持在黑暗中。
9、停止溶液为稀硫酸。避免直接接触皮肤和其他物品。
储存和到期
储存条件:除HRP基质和停止溶液储存在2-8°C外,所有其他成分和板条均可冷冻储存。
有效期:自装运之日起冰箱储存约6个月。如果不打算很快使用,用户可以将分析板,
HRP抗SAM抗体、标准品、HRP抗体和样品稀释液在冷冻柜中储存更长时间或/和更好的结果。